Entwicklung eines Pretargeting-Ansatzes unter Nutzung radioaktiv markierter L Oligonukleotide

Ziel:

Gegenstand der Forschungsarbeiten ist die systematische Entwicklung eines geeigneten Pretargeting-Modells für die Endoradionuklidtherapie unter Verwendung komplementärer L konfigurierter Oligonukleotide (L ON). Ziel dabei ist die Bewertung der in vivo Hybridisierungseigenschaften hinsichtlich ihrer Eignung zur radiodiagnostischen und -therapeutischen Verwendung bei Tumorerkrankungen.

Methodik:

Modifizierte 12- und 17-basige L-RNAs wurden mit DOTA-Derivaten funktionalisiert und im Anschluss mit den PET-Nukliden ⁶⁸Ga und ⁸⁶Y markiert. Die Hybridisierung wurde u. a. in Rattenvollblut in Abhängigkeit von der Konzentration untersucht. Weiterhin wurden die Bioverteilung sowie Metabolitenuntersuchungen in männlichen Wistar Ratten durchgeführt (1).
Als Modellsystem dienen DOTA-modifizierte Human Serum Albumin Mikrosphären (HSAM, Durchmesser 20 30 μm). Nach intravenöser Applikation dieser Partikel kommt es auf Grund ihrer Größe zum vollständigen Trapping der Mikrosphären in der Lunge (2, siehe Abb. 1). Analog zu diesen Untersuchungen ist geplant, diese Partikel mit L-ON zu modifizieren und somit eine in vivo Hybridisierung in der Lunge zu ermöglichen. Mit Hilfe dieses Ansatzes wäre man in der Lage, quantitative Beurteilungen des in vivo Hybridisierungsverhaltens komplementärer L-ON vorzunehmen. Zunächst erfolgen in vitro Tests, um das Hybridisierungspotenzial der auf der HSAM-Oberfläche präsentierten L ON zu verifizieren. Zudem wurde eine erste in vivo Untersuchung mittels Kleintier-PET und Urinanalyse durch aufeinander folgende intravenöse Verabreichung von L ON-HSAM-Konjugaten und der komplementären, radioaktiv markierten RNA Stränge vorgenommen.

Ergebnisse:

Die in Abbildung 2 dargestellten Ergebnisse unter Verwendung eines [⁸⁶Y]Y-DOTA-17mers sind exemplarisch für die Bioverteilung der ⁸⁶Y markierten L-ON. Bereits 5 min p. i. wurden 16 ± 5 % der injizierten Dosis renal ausgeschieden sowie 20 ± 2 % in der Niere akkumuliert (zum Vergleich zeigte ein 12mer eine renale Ausscheidung nach 5 min von nahezu 82 % ID). Nach 60 min sank die im Tier verbleibende Aktivitätsmenge auf 26 ± 2 %. Es lagen keine signifikanten Akkumulationen in anderen Organen vor (1). Die hohe in vivo Stabilität konnte anhand der Metabolitenanalyse nachgewiesen werden. 60 Minuten p. i. konnten im Urin 80 % und im Nierenhomogenat 81 % der vorliegenden markierten Substanz dem intakten 17mer zugeordnet werden. Konzentrationsabhängige Untersuchungen in Rattenvollblut ergaben eine maximale Hybridisierung bei einem Stoffmengenverhältnis von 1:1.
Aufgrund der vorteilhafteren Ergebnisse in Bezug auf biologische Verfügbarkeit und Hybridstabilität werden die nachfolgende Modellansätze mit 17-basigen L ON durchgeführt. Die kovalente Verknüpfung der RNA über eine Amid- oder Thioharnstoffbindung mit unbehandelten sowie DOTA-modifizierten HSAM ist auf Grund der Vielzahl an Amino- und Carboxylgruppen auf der Oberfläche der Partikel (elektrostatische Wechselwirkungen und starke Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Oligonukleotiden und HSAM) unter den bisher getesteten Bedingungen nur in geringen Ausbeuten möglich. Erste in vitro Hybridisierungstests ergaben positive Ergebnisse, wobei die entstandenen Hybride an der HSAM-Oberfläche lokalisiert sind. Bei einer in vivo Untersuchung wurde jedoch im Urin 45 % der vorhandenen Aktivitätsmenge den entstandenen Hybriden zugeordnet. Um das Problem der Adsorption von L ON auf der Partikeloberfläche zu lösen, werden die HSAM in weiteren Untersuchungen zuerst mit hydrophoben Reagenzien modifiziert, um eine kovalente Bindung zu gewährleisten. Als alternativer Ansatz werden zurzeit carboxylfunktionalisierte Polystyren-Mikrosphären analog modifiziert und untersucht. Zudem wird daran gearbeitet, die rasche renale Ausscheidung sowie die hohe Nierenakkumulation zu verringern. .....