Synthese, ¹⁸F-Markierung und radiopharmakologische Charakterisierung eines 30mer-Peptids als potentieller Radiotracer für die molekulare Bildgebung von Claudin-4 mittels PET

Der Zelloberflächenrezeptor Claudin-4 (Cld-4) wird in verschiedenen Tumoren überexprimiert und stellt daher ein potentielles Target sowohl für die Diagnose als auch die Therapie von Tumoren epithelialen Ursprungs dar. Dies lässt die Entwicklung von Sonden, die das in vivo-Imaging dieses Proteins ermöglichen, attraktiv erscheinen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwiefern sich das C-terminale Fragment der C-terminalen Domäne des Clostridium perfringens-Enterotoxins cCPE(290-319) für die PET-Bildgebung von Cld-4 eignet. Dieses Fragment besteht aus 30 Aminsäuren und weist die Sequenz SLDAGQYVLVMKANSSYSGNYPYSILFQKF auf, was den Positionen 290-319 im cCPE entspricht.
Die Synthese des cCPE(290-319) und davon abgeleiteter Analoga, insbesondere N-terminal fluorbenzoylierter und FITC-konjugierter Derivate sowie Varianten, in denen kritische Aminosäuren (Tyr 306 und Leu 315) ausgetauscht wurden, sollte durch Festphasenpeptidsynthese erfolgen. Unter verschiedenen erprobten Strategien erwies sich die sequentielle Festphasenpeptidsynthese unter Einsatz von drei Pseudoprolin-Dipeptiden am effizientesten, um cCPE(290-319) und dessen Derivate zugänglich zu machen. Die Affinität der erhaltenen Peptide zu einem artifiziellen Proteinkonstrukt bestehend aus beiden extrazellulären Domänen des Cld-4 wurde mit Hilfe der Oberflächen-Plasmonenresonanz (SPR) untersucht, wodurch ein K_d-Wert von 1.4 µM für das N-terminal 4-fluorbenzoylierte cCPE(290-319) ermittelt wurde. Die Markierung von CPE(290-319) mit Fluor-18 erfolgte an fester Phase mit Hilfe von N-Succinimidyl-4-[¹⁸F]fluorbenzoat ([¹⁸F]SFB) und 4-[¹⁸F]Fluorobenzoylchlorid. Dabei wurden die besten Resultate erzielt, wenn harzgebundenes cCPE(290-319) mit N-terminalem 6-Aminohexansäure-Spacer mit [¹⁸F]SFB zur Reaktion gebracht wurde. Die Inkubation des auf diese Weise erhaltenen Radiotracers mit Zellüberstand und Blutplasma ließ keine Anzeichen von Instabilität in diesen physiologischen Medien erkennen. Die Zellbindung von ¹⁸F-markiertem cCPE(290-319) wurde mit den Tumorzelllinien HT29, A375 und A431 untersucht. Dabei konnte die zeitabhängige Bindung des radiomarkierten Peptids an Cld-4-positive A375- und A431-Zellen beobachtet werden, die stärker war als im Fall der Cld-4-negativen HT29-Zellen. Dieses Ergebnis wird gestützt durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie mit FITC-konjugiertem cCPE(290-319) an A431-Zellen. Das in vivo-Verhalten von 18F-markiertem cCPE(290-319) wurde durch dynamisches PET-Imaging und Radiometabolit-Analysen in NMRI nu/nu-Mäusen bzw. Wistar-Ratten evaluiert. Dabei hat sich gezeigt, dass ¹⁸F-markiertes cCPE(290-319) schnell metabolisiert wird und einer deutlichen Aufnahme in die Leber unterliegt.