Synthese Dipeptid-abgeleiteter Alkine als irreversible Inhibitoren von Cathepsin B

Die hier dargelegte Arbeit knüpft an den bereits vorhandenen Erkenntnissen unserer Forschungsgruppe am HZDR an und gründet auf den bisherigen Arbeiten von L. Behring. Der Schwerpunkt dieser Forschungsgruppe liegt auf der Hemmung von Cathepsin B, einem in malignen Tumoren überexprimierten Enzym. Durch die Arbeiten von GREENSPAN et al. konnte bisher gezeigt werden, dass der nitrilfunktionalisierte Inhibitor mit einem Carboxybenzyl-Rest in P1 und einem 3-Methylphenyl-Rest in P2 sich besonders für die Hemmung des Enzyms eignet. Ausgehend von diesen Erkenntnissen sollte das durch GREENSPAN et al. synthetisierte Molekül als Leitstruktur verwendet werden, um daraus irreversible alkinfunktionalisierte Inhibitoren zu synthetisieren. Der Vorteil dieser Inhibitoren ist, dass sie sich, im Gegensatz zu Nitrilen, nicht vom Target ablösen. Um einen Vergleich in ihrer Hemmwirkung festzustellen, sollten die analogen reversibel bindenden nitrilfunktionalisierten Inhibitoren hergestellt werden. Im Vorfeld wurde bereits der alkinfunktionalisierte Inhibitor der analogen Greenspan-Verbindung synthetisiert. Da dieser jedoch als Diastereomerengemisch vorlag, stand die Synthese stereo-chemisch reiner alkinfunktionalisierte Inhibitor im Vordergrund. Die enzymatischen Messungen der synthetisierten Inhibitoren übernahm L. Behring. Die im Folgenden diskutierten Ergebnisse aus den Messungen sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Die Synthese des nitrilfunktionalisierten Inhibitors mit 4-Fluorbenzoyl-Rest in P3, 3-Methylphenylalanyl-Rest in P2 und zwei Protonen in P1 gestaltete sich schwieriger, als die des analogen Alkin-Derivats. In den RP-HPLC-Spektren des nitrilfunktionalisierten Inhibitors konnten, besonders während der Boc-Entschützung, viele Nebenprodukten nachgewiesen werden. Diese entstanden aufgrund der höheren Elektrophile der Nitrilgruppe. Diese Nebenprodukte bedeuteten eine zusätzliche Reinigung, welche sich auf die Ausbeuten auswirkte. Es wurde daher für die weiteren nitrilfunktionalisierten Inhibitoren beschlossen, die Dehydratisierung des weniger reaktiveren Amids zum Nitril auf das Ende der Synthese zu planen. Die Ausbeute des nitrilfunktionalisierten Inhibitors lag über drei Schritte bei 30 %. Im Vergleich dazu wurde der alkinfunktionalisierte Inhibitor mit 60 % über drei Schritte erhalten. Der bestimmte Ki-Wert zeigte für den nitrilfunktionalisierten Inhibitor 6 einen Wert von 1,19 µM. Der analog synthetisierte alkinfunktionalisierte Inhibitor 3 zeigte keine enzymatische Hemmung. Es ist davon auszugehen, dass dieser unzureichend im Enzym fixiert wurde und die Addition des Thiolats im aktiven Zentrum an das Alkin nicht stattfinden konnte.
Die zweite Gruppe der synthetisierten Inhibitoren unterschied sich im Rest P1 zu den Vorangegangenen. Es konnte gezeigt werden, dass die Inhibitorwirkung mit zwei Protonen in Position P1 für nur geringe Hemmung am Cathepsin B sorgt. Durch die Arbeiten von GREENSPAN et al. wurde daher der Carboxybenzylserin-Baustein in P1 gewählt. Die Synthese des nitrilfunktionalisierten Inhibitors verlief über eine zehnstufige Synthese und brachte eine Ausbeute von 8 % hervor. Der größte Verlust bei der Synthese von 16 und 30 wurde in der Alkylierung des Serin-Bausteins mit dem allylgeschützten Carboxybenzyl-Rest beobachtet. Die Reaktion verlief nur mit Ausbeuten von ca. 30 % (Verbindung 16) bzw. 40 % (Verbindung 30) und bereitete während der Synthese die meisten Schwierigkeiten. In der Arbeit wurden daher verschiedene Reaktionsbedingungen getestet. Im Falle des nitrilfunktionalisierten Inhibitors 16 wurde die Temperatur für die Deprotonierung variiert, wobei mit sinkender Temperatur die alkylierende Veresterung des Boc-geschützten Serins der Seitenkettenalkylierung vorgezogen wird. Das entstandene Esterprodukt wurde isoliert, spektroskopisch untersucht und mit dem der alkylierten Verbindung verglichen. Im Falle des alkinfunktionalisierten Inhibitors 30 wurde ebenfalls die Temperatur und die Zeit für die Deprotonierung untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Temperatur während der Deprotonierung wenig Einfluss auf die Reaktion besitzt. Anders war es bei der Zeit für die Deprotonierung. Hier wurde durch ¹H-NMR-Auswertung und RP-HPLC gezeigt, dass sich bei langen Deprotonierungszeiten ein intramolekular entstandenes Oxazolidinon bildete, welches durch anschließende Zugabe des Alkylierungsmittels zur N-Alkylierung neigt.
Die ansonsten stereokonservative Synthese, ausgehend vom L-Serin über den Garner-Aldehyd verlief mit hohen Ausbeuten und einfachen Reinigungsschritten. Die spektroskopische Mosher-Säure-Analyse des rückreduzierten Garner-Aldehyds zeigte, dass die stereochemische Integrität während der Aldehyd-Synthese erhalten blieb. Auch nach der Kupplung zum Dipeptid und damit der Einführung eines zweiten Stereozentrums konnten nur geringe Peakdopplungen (Anteil ≤ 4 % des ungewünschten Diastereomers) im 1H-NMR nachgewiesen werden. Die Messung des Dipeptidalkins 30 führte ebenfalls zum Erfolg. Es konnte durch die Messung am isolierten Enzym bewiesen werden, das er eine irreversible Bindung mit dem Enzym eingeht. Durch vorangegangene Arbeiten unserer Arbeitsgruppe konnte außerdem gezeigt werden, dass sich das Molekül mit 4-Fluorbenzoyl-Rest in P3 besser eignet als das bereits hergestellte Epimerengemisch mit 2,4-Difluorbenzoylrest in P3.
Der fünfte Inhibitor 40 wurde ausgehend vom kommerziell erhältlichen Propargylserin synthetisiert. Die Reaktion verlief mit 9 % Ausbeute über acht Reaktionsschritte. Die Synthese des Inhibitors verlief trotz geringerer Ausbeuten nahezu unproblematisch. Der letzte Schritt der Methylester-Entschützung bereitete zunächst Probleme, wobei es zur partiellen Racemisierung des Inhibitors kam. Diese konnten jedoch durch Verkürzen der Reaktionszeit und Einsatz der Base im Unterschuss fast komplett unterdrückt werden. Der Inhibitor konnte, ähnlich wie das Dipeptidalkin 30 mit ≤ 3 % des unerwünschten Diastereomers synthetisiert werden. Da der Triazol-Inhibitor 40 schlechter ist als der mit einem Proton in P1 (Verbindung 6), ist die Synthese des entsprechenden Alkins nur wenig aussichtsvoll. Durch die unzureichende Bindung des Inhibitors in den Enzymtaschen ist, wie bei Inhibitor 6, keine irreversible Bindung zu erwarten. Ein Ausblick ist die stereoisomerenreine Synthese des 2,4-difluorbenzoylierten Inhibitors zum direkten Vergleich mit dem analogen Diastereomerengemisch. Weiterhin soll der Rest in P3 durch ein 4-Phenylbenzoyl-Rest ersetzt werden. Dieser besitzt ein größeres π-Elektronensystem, wodurch die Wechselwirkungen mit den π-Elektronen des Tyrosins in der Enzymtasche S3 verbessert werden sollen. Da anschließend eine Radiomarkierung der Verbindung erfolgen soll, bietet es sich an, den analogen 4-(4-Fluorbenzyl)-benzoyl-Rest an die Position P3 zu binden. Eine weitere Modifikation, wäre die Än-derung des P2-Rests von Methylphenylalanin zu Monoiodtyrosin. In den Arbeiten von XING et al. zeigten Tyrosin-Derivate, speziell die iodierten Tyrosin-Derivate eine besonders potente Hemmwirkung gegenüber Cathepsin B. Dieser Substituent könnte eine verbesserte Wechselwirkung mit der Aminosäure Glutaminsäure (Glu 245) in Enzymtasche S2 bewirken.